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共聚焦顯微鏡中，測定共定位的能力受限于光學系統的分辨率及用于照明樣品的入射光波長。寬場熒光和共聚焦顯微鏡理論分辨率約為200nm，但在實際上，由于各種原因這個數降到400nm和600nm之間，原因包括顯微鏡光路未完全對準、光學折射率波動、光學像差及樣品制備的不合適。然而，對于一個已經完全調好的共聚焦顯微鏡來說，兩個熒光分子是否連接到同一個目標對象上，或者它們是否定位在同一個器官上受光學分辨率影響。共定位的許多實驗是圍繞高特異性的合成探針和抗體進行的，標記目標是容易區分的局部的、明確的細胞結構。
共聚焦顯微鏡的掃描器內密封有檢測針孔光欄、分光鏡、發射熒光分色器及檢測器。當熒光樣品中的混合熒光進入掃描器，經過檢測針孔欄、分光鏡和分色器選擇后，被分成各單色熒光，分別在不同的熒光通道進行檢測并形成相應的共焦圖像，同時在計算機屏幕上可以顯示幾個并列的單色熒光圖像及其合成圖像。
針孔是共聚焦顯微鏡中的一個重要組成部分，它是放在檢測器及激光光源前面的一個小孔，作用是控制光切片的厚度，對實現斷層掃描成像，排除焦面雜散光起關鍵作用；
分光鏡的作用是按照波長來改變光線的傳播方向；
發射熒光分色鏡的作用是選擇出一定的波長范圍的光進行檢測，不同型號的儀器采用的分色器的部件有所不同。目前用于分色器的部件主要由濾光片、棱鏡和光柵三種類型；
檢測器采用高靈敏度的光電倍增管，其檢測的范圍和靈敏度可根據強度進行連續調節。
